实时荧光定量PCR检测
一、原理
实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR）是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，以cDNA为模板，对PCR产物进行荧光标记以及荧光信号的跟踪，实时监测反应进程。由于每个反应管中荧光强度达到阈值所需的循环数（Ct值）与样本初始拷贝数存在线性关系，最后可参照内参通过Ct值对待测样品模板进行定量分析。整个过程具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。
二、服务内容
1、 从人或动物组织样本、细胞样本提取RNA；
2、 对RNA进行浓度及纯度分析；
3、设计特异性荧光定量PCR检测引物或探针，通过qPCR对目的基因和内参基因表达水平进行检测，根据实验要求进行数据统计及分析。
三、实验流程
A. RNA提取
RNA提取是qPCR实验成功的敲门砖，RNA的质量直接关乎整个qPCR实验的成败。但翻车总在不经意间，其实主要的原因在于RNA分子结构的不稳定性、环境中无处不在的RNase以及环境温度对RNA 的降解造成的加速作用，那么如何提取出高质量的RNA呢，我们给您以下建议：
1. 样本的选择：进行RNA提取的样本最好选择新鲜的细胞样本和组织样本；
2. 样本的采集和保存：采集样本时，尽量在低温环境下采集，不要将样本置于室温环境下，建议采集样本后先在液氮中速冻然后再转移到负80度冰箱保存或干冰运输。获取样本后，最好立即提取RNA，如需将组织样本进行长途运输，则应将样本放于充足的干冰中进行远途运输，切忌使用冰袋进行运输；对于细胞样本，建议将细胞样本保存在Trizol中用干冰进行远途运输。
3. 不建议大家用胰酶消化细胞后收集细胞沉淀进行RNA提取，因为胰酶会对细胞活性产生影响，这里建议在细胞处理完后将Trizol或细胞裂解液直接加入培养板中进行裂解细胞的收集，用Trizol进行裂解提取RNA时全程在冰上操作防止RNA因温度过高造成降解，这种方法可以保证样本的新鲜度及RNA的完整性。强烈不建议大家将提取好的RNA进行运输，如需运输则需将RNA反转成cDNA，对于提取完的RNA建议立即反转成cDNA，因为与RNA相比cDNA更加稳定且不易降解，并且将RNA反复冻融也会对RNA造成一定程度的降解。反转好的cDNA需要放入-20℃存放。
Tips:
为了避免环境中的RNase污染，实验前应将实验台面用75%酒精消毒，实验过程全程佩戴口罩、手套等。实验过程使用枪头及EP管等耗材应为RNase-free处理过的，处理不同组织样本时应对剪刀和镊子进行多次消毒，防止样本间的干扰和污染。
为了避免RNA降解，实验过程要尽量处于低温环境，研磨仪适配器应经过-80冷冻处理；如您是手动研磨，建议在研钵中加入液氮后再手动研磨组织或细胞。如果不能确定RNA是否存在降解现象，可进行琼脂糖凝胶电泳判断RNA是否完整及RNA是否存在降解问题，注意跑RNA琼脂糖凝胶电泳时跑胶时间不宜过长，若时间过长因跑胶装置产热也会造成RNA降解。对于真核生物来说，完整的RNA应该有三条带，分别是28S、18S及5S，28S与18S的条带亮度之比应为2:1（如图所示）。若发现5s条带亮度很高且28s和18s的条带呈弥散状态，证明RNA已发生严重降解，建议重新进行RNA提取。
B. 反转录
反转录也是cDNA合成，是qPCR的重要环节，是以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA(complementary DNA，cDNA)的过程。qPCR的实验中不同样本内参的循环数差异不要超过2个循环，当遇到qPCR内参循环数差距太大的情况，就要进行内参调整，这时cDNA的作用就尤为重要，如某样本与其他样本内参CT值差异在2个循环以上，可将CT值差异较大的样本cDNA做不同梯度的倍比稀释后进行qPCR，选择CT值差异小于2个循环的cDNA稀释倍数进行实验。一般情况下cDNA稀释一倍，CT值会增大1个循环左右；此外，建议将RT完毕的cDNA进行同倍体积的稀释，并将cDNA分装使用，这一步骤是为了减少枪头和吸取的微量cDNA的细微差异而造成的误差，提高三复孔重复性。
C. 检测
1. 扩增CT值偏大
如果某基因第一次扩增，CT值就大于30甚至无法扩增出来，这种情况可能是扩增效率低导致的，也有可能是该基因在待测样本中的表达丰度低。解决方法如下：
a. 引物质量差：无法扩增出来这种情况有可能是引物质量差造成的，建议更换引物进行尝试，或者改用灵敏度高的PCRmix来进行实验。
b.表达丰度低：针对表达丰度较低的基因，建议可以通过提高模板量来改善CT值偏大的问题，比如可以尝试使用一步法来进行实验。在qPCR实验前建议在网站中查询该基因的表达情况（https://www.uniprot.org/）提前设计适合的实验方案。
c. 扩增产物过长：扩增产物长度最好不要超过300bp，如果扩增产物过长建议将两步法程序改为三步法进行实验，这样扩增曲线会有一定程度改善。
2. 熔解曲线异常
熔解曲线可以用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，而异常熔解曲线会出现双峰，杂峰等情况
a.双峰，杂峰Tm在80℃之前可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化；也有可能是模板量偏低，促使引物二聚体的形成，建议重新制备纯度较高的cDNA。
b.双峰，杂峰Tm在80℃之后
引物特异性过低造成非特异性扩增，建议重新设计引物改善特异性，设计后建议用blast验证引物特异性是否良好。
c.尝试许多方法双峰、杂峰仍无法改善
出现这种情况建议更换识别能力强，条件兼容性更高的PCR试剂，mix的不同会对PCR的结果有不同程度的影响，针对表达丰度低的基因，改变mix会有一定程度的帮助。
四、产品优势
1. 高通量组织研磨机：
我公司拥有高通量组织研磨机，可一次实现多达48个样本同时快速低温研磨，大大降低组织样本降解的概率。
2. RNA质检：对于非新鲜制备样本，RNA提取后均需进行RNA质检工作，以保证后续实验的可信度。
3. 实验过程透明真实：最终提供实验过程中RNA提取、逆转录及qPCR过程照片，实验结果可追溯。
4、多台高质量荧光定量PCR仪，保证数据的稳定输出。
5.报告结果详细明确，易于查阅。
五、SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别
六、技术应用
