稳转细胞系的构建

实验原理       稳定转染就是将外源基因DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代,从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。        瞬时转染/感染的特点:外源DNA不整合到宿主的染色体中,一个宿主细胞中可以存在多个拷贝数,产生短时间内的高水平的表达(只能持续几天);外源基因的表达水平不存在整合位点的问题,不会受到周围染色体元件的影响;瞬时转染所需的人力和时间...

实验原理

       稳定转染就是将外源基因DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代,从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。 

       瞬时转染/感染的特点:外源DNA不整合到宿主的染色体中,一个宿主细胞中可以存在多个拷贝数,产生短时间内的高水平的表达(只能持续几天);外源基因的表达水平不存在整合位点的问题,不会受到周围染色体元件的影响;瞬时转染所需的人力和时间比稳转少,但DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大,因此表达不长久也不稳定。

      稳转细胞株的特点:经合适的药物浓度进行药物筛选后,可得到外源DNA整合到宿主染色体的细胞,这些细胞可以长时间表达外源目的基因,稳定表达细胞株弥补了瞬时感染(或转染)实验中外源基因表达时间短的缺陷,便于长期观察。稳转细胞的筛选需根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,常用的抗性筛选有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)、灭稻瘟素(Blasticidin)等。若实验需求构建稳转细胞株,我们建议通过慢病毒感染细胞进行药物筛选的方法,此方法较质粒转染可以更加有效的将外源基因整合入基因组,且整合位点处于转录相对活跃的区域,从而获得更加高效表达外源基因的稳转株细胞。

       舍为斯生物具有丰富的稳转细胞系构建经验,可为客户提供悬浮细胞/贴壁细胞的过表达/干扰基因多克隆/单克隆稳转细胞系构建服务。


技术应用

如秩序要观察外源基因表达后较短时间内就能检测的细胞功能,可使用瞬时转染/感染。即在转染后24至96小时内收获细胞;如需要长期观察外源基因表达的作用,进行长期药理学研究、基因治疗研究、遗传调控机制研究或需要进行大规模蛋白合成则需要构建稳转株。

 


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