ELISA的四种类型：

利用酶标记的抗原或抗体，在固相载体上进行的抗原或抗体的测定。

基本方法有：直接法、间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。

一、直接ELISA：

将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。

优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。

缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高

二、间接法ELISA:

原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。

优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。

缺点：交叉反应几率升高。

三、双抗夹心法ELISA

原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。

双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。

优点：高特异体

性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的；适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测；灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。

缺点：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位；不适用于检测小分子物质。

四、竞争ELISA

原理：竞争法ELISA最为复杂，通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等。样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争相同的有限量抗体，当样品中的游离抗原越多，就可结合越多的抗体，而固相抗原只能结合较少的抗体。反之亦然。经洗涤去除样品中的抗原与抗体的结合物，只留下固相抗原与抗体的结合物。显示经计算可得样品中抗原的含量。竞争法可根据实验设置直接法、间接法或夹心法形式。

试剂盒性能：

1.检测范围：

建立线性范围：需测定9-11个浓度水平，每个浓度水平重复测定3-4次。

验证标称线性参数：需测定4-6个浓度水平，每个浓度水平重复测定3-4次。

所有样本应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，最好在一天之内完成。

2.灵敏度：

示例：人 IL-13 的最低可检测浓度为 0.1 pg/ml (6 次独立实验的平均值)。 10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD，计算最低可检测浓度。

注意：灵敏度跟检测范围最低点不相等。

3.稳定性（重复性、精密性）

酶标板内精密度 3 个已知浓度的样本酶标板内重复测定 20 次，评估酶标板内的精密度。 酶标板间精密度 3 个已知浓度的样本酶标板间重复检测 6 次，评估酶标板间的精密度。

试剂盒一般板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% （统计学概念）

4.准确度（回收率）

示例：5 份健康人血清中加入 3 个不同浓度水平的人 IL-13，未加人 IL-13 的血清作为本底，计算回收率。回收率的范围从 82 %至 110 %，平均回收率为 98 %。

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